2023 Autor: Bailey Leapman | [email protected]. Viimati modifitseeritud: 2023-05-20 22:44
Stanfordi ülikooli uurimisrühm on välja töötanud esimese mikroskoobi, mis on piisav alt tundlik, et jälgida üksiku valgu liikumist reaalajas kuni selle üksikute aatomite tasemeni. Ajakirja Nature 13. novembri veebinumbris kirjutavad Stanfordi teadlased, kuidas uus instrument võimaldas neil lahendada pikaajalisi teaduslikke vaidlusi selle üle, kuidas DNA-st geene kopeeritakse – see on biokeemiline protsess, mis on eluks hädavajalik.
Teises artiklis, mis avaldati novembris.8 ajakirja Physical Review Letters veebiväljaandes pakuvad teadlased üksikasjalikku kirjeldust oma uudsest seadmest, "optilise lõksu" täiustatud versioonist, mis kasutab infrapunavalgust funktsionaalse valgu jõudude püüdmiseks ja kontrollimiseks, võimaldades teadlastel jälgida. molekuli iga liigutus reaalajas.
"Nature-eksperimendis teostasime üksiku valgu kõrgeima eraldusvõimega mõõtmise, mis on kunagi tehtud, " ütleb rakendusfüüsika ja bioloogiateaduste professor Steven Block. "Saime mõõtmised ühe angströmi ehk kümnendiku nanomeetri täpsusega. See on kaugus, mis on võrdne ühe vesinikuaatomi läbimõõduga ja umbes 10 korda peenem kui mis tahes eelnev mõõtmine."
Block kirjutas ajakirjas Nature and Physical Review Letters avaldatud artiklid koos oma Stanfordi labori kolme praeguse liikme – kraadiõppurite Elio Abbondanzieri ja William Greenleafi ning järeldoktorantuuri Michael Woodside’iga – koos endise magistrandi Joshua Shaevitziga, kes töötab praegu California Berkeley ülikool ja kauaaegne kaastöötaja Robert Landick Wisconsini ülikoolis.
Keskdogma
Nature-uuringus käsitlesid Block ja tema kolleegid bioloogia põhiprintsiipi, mida tuntakse keskse dogmana ja mille kohaselt liigub elusorganismides geneetiline teave DNA-st RNA-lt valkudesse.
Protsess algab DNA-ga, kuulsa topeltheeliksiga, mis talletab geneetilisi andmeid. DNA-d võrreldakse sageli keerdredeliga, mis koosneb kahest ahelast, mis on ühendatud molekulaarsete pulkadega, mida nimetatakse "alusteks" ja mida tuntakse lühendite A, T, G ja C all. Pikemad DNA järjestused kodeerivad geene, mis sisaldavad selgeid juhiseid spetsiifilise struktuuri loomiseks. valk.
Tüüpiline DNA redel kannab tuhandeid geene, mis kodeerivad tuhandeid valke, mis hoiavad organismi elus ja toimimas. Üks valesti paigutatud täht geeni DNA järjestuses – näiteks G, mis on asendatud tähega T – võib tekitada defektse valgu, mis võib põhjustada tõsise haiguse.
Transkriptsioon
Blocki meeskond keskendus keskse dogma olulisele etapile, protsessile, mida tuntakse kui "transkriptsiooni", kus iga geen kopeeritakse DNA-st RNA-le. Transkriptsioon algab siis, kui ensüüm nimega RNA polümeraas (RNAP) lukustub DNA redeli külge ja tõmbab väikese osa pikuti laiali. Seejärel ehitab RNAP ensüüm uue, komplementaarse RNA ahela, kopeerides keemiliselt iga aluse ühes eksponeeritud DNA ahelas. RNAP jätkab liikumist mööda DNA ahelat allapoole, kuni geen on täielikult kopeeritud.
Looduskatse jaoks kasutasid Block ja tema kolleegid E. coli bakteritest ekstraheeritud DNA-d ja RNAP-d, mis on märkimisväärselt sarnane RNAP-ga keerukamates organismides, sealhulgas inimestel. "RNAP on üks olulisemaid ensüüme looduses, " ütleb Block. "Ilma selleta poleks RNA sõnumeid, valke ega elu."
Ussid ja krigistamine
Teadlaste seas on intensiivselt vaieldud selle üle, kuidas transkriptsioon täpselt molekulaarsel tasemel toimib.
"Inimesed on aastaid teadnud, et RNA-st valmistatakse üks alus korraga, " ütleb Block. "Aga see on jätnud lahtiseks küsimuse, kas RNAP ensüüm ronib DNA redelist tegelikult ühe astme haaval üles või liigub see hoopis tükkidena – näiteks lisab kolm RNA alust, siis hüppab kaasa ja lisab veel ühe kolm alust." Viimane protsess, mida nimetatakse katkendlikuks pikendamiseks, on nagu raamatu lugemine, selgitab ta: "Kui sa loed, ei tõsta sa oma silmi ühe tähe kaupa ette. Sa 'tükid': loed seda tükkidena.'
Kaks pideva pikenemise kohta on pakutud välja kaks põhihüpoteesi:
- See inchworm mudel, milles RNAP liigub mööda DNA-d nagu uss, kusjuures ensüümi esiots on alati tagaosa ees.
- Kõrjutusmudel, mille puhul RNAP tõmbab sisse ("kriibib") DNA ahela, kopeerib iga ahela aluse ja haarab seejärel redelist ülespoole veel ühe ahela.
Õige mudeli kindlaksmääramine on olnud keeruline väljakutse, sest seni polnud ükski instrument piisav alt tundlik, et jälgida iga RNAP-i transkriptsiooni käigus DNA-s tehtud mikroskoopilist sammu. Selle põhjuseks on asjaolu, et tavalised optilised püünised ei suuda mõõta midagi väiksemat kui umbes 10 angströmi (1 nanomeeter). Kuid iga DNA redeli alust – A, T, G või C – eraldab vaid umbes 3,4 ongströmi. "Minu labor on suurema osa kümnendist väga kõvasti tööd teinud, et murda nanomeetri barjäär ja saavutada angströmitaseme eraldusvõime," ütleb Block.
Valgus ja liikumine
Selle eesmärgi saavutamiseks pidi Blocki meeskond ületama kaks tavapäraste jõuklambritega kaasnevat probleemi: kõikuvad signaalid ja painduvad valguslained.
"Kui valgustate laserit läbi õhu, liigub valguskiir veidi ringi, samal põhjusel, miks tähed taevas sädelevad," selgitab Block. "Kuid me tahame seda kiirt kasutada millegi asukoha mõõtmiseks aatomi suuruse piires, nii et kui kiir liigub vaid 1 angströmi, on loo lõpp. Võtsime kogu mikroskoobi välise optika, sulgesime need suletud karpi ja asendasime õhu heeliumigaasiga, mille murdumisnäitaja on 10 korda lähemal vaakumile kui õhule. Nii et jämed alt öeldes saate 10 korda vähem silmapilgutamist ja instrumenti, millel on angströmi tasemel stabiilsus."
Lisaks valguse stabiliseerimisele pidid teadlased täiustama ka jõu ja nihke tuvastamise meetodit. Optilised jõuklambrid kasutavad DNA ja teiste molekulide kinnipüüdmiseks infrapuna-laserkiire pisikesi jõude. Tavalises jõuklambrikatses kinnitatakse mikroskoopilised helmed pika DNA molekuli vastasotste lähedale – selline paigutus meenutab tõstja hantlit. Üks RNAP ensüüm, mis on kinnitatud ühe helme pinnale, liigub seejärel mööda DNA-d ja ajab välja komplementaarse RNA ahela, tõmmates hantli otsad edenedes üksteisele lähemale. Kahte hantli moodustavat helmest hoitakse tavaliselt kahe eraldi optilise lõksu keskel. Kuid kraadiõppur William Greenleaf avastas, et kui üks kahest hantli helmest asetada selle lõksu välisserva lähedusse, jääb sellele mõjuv jõud konstantseks, võimaldades kiiresti ja tõhus alt angströmi taseme mõõtmisi teha.
"See on just see, mida sa tahad – klamber, mis võimaldab RNAP-il karistamatult liikuda, kuid jõud ise ei muutu," ütleb Block. "Tavaliselt on rant lõksu sees keskel, kuid otse lõksu servas on meil see maagiline omadus, kus jõud on konstantne."
Erinev alt tavapärastest instrumentidest ei vaja uus jõuklamber konkureerivate jõudude korrigeerimiseks aeganõudvaid arvutiarvutusi. "See uus tehnika on täiesti passiivne, nagu termos, mis lihts alt istub ja hoiab midagi jahedat, " ütleb Block. "Peame vaid süsteemi valgustama ja kõik läheb ise korda. Selle tulemusel saime lõpuks miinuse, 3, lahendada.4-angströmi sammud, mida E. coli RNAP teeb bakterigeeni transkribeerimisel."
Arutelude lahendamine
Nende uuendustega näib uurimisrühm olevat lahendanud mõned põhiargumendid DNA-RNA transkriptsiooni üle. "Lihts alt öeldes välistab meie katse mõlemad katkendliku asukoha mudelid, " ütleb Block. "Ei inchworm ega krigistamismudel ei ole meie andmetega kooskõlas ja idee, mida mõned on kogu aeg pidanud – et RNAP ronib DNA-redelil üks aluspaar korraga -, on ilmselt õige vastus."
Stanfordi grupp kaalus ka teist poleemikat, mis puudutas tegelikku mehhanismi, mis võimaldab RNAP-il edasi liikuda. "RNAP on molekulaarne mootor, mis algab DNA ühest otsast ja liigub teise otsa, " selgitab Block. "See saab oma energia keemilisest reaktsioonist, mis tekib siis, kui ta kopeerib A, T, G või C. Tundub, nagu asfaldi laotav masin saaks kuidagi asfaldi enda jõul käia."
Teadlased on välja pakkunud kaks erinevat mudelit, et selgitada, mis seda molekulaarset mootorit juhib:
- Jõulöögimudel, milles kogunenud energia tõukab ensüümi edasi – nagu koormatud vedru, mis perioodiliselt vabaneb.
- Browni (või termilise) põrkmehhanismi mudel, mille puhul juhuslik soojusenergia põhjustab RNAP ensüümi edasi-tagasi kõigumise. Iga sissetulev DNA alus lukustab seejärel ensüümi ettepoole, nii et see ei saaks tahapoole nikerdada. "See oleks nii, nagu põrkaksite korduv alt vastu seina ja iga kord, kui juhtute põrgatama natuke kaugemale, tuli keegi sisse ja nihutas seina teie selja taha, nii et te ei saaks nii kaugele tagasi põrgata. triivib end edasi, kuigi teie enda liikumine oli enamasti juhuslik," selgitab Block.
Nature-uuringus jõudsid Block ja tema kolleegid järeldusele, et Browni põrkmehhanismi mudel on RNAP-i jaoks tõenäoliselt õige, kuigi arvatakse, et mitmed teised motoorsed valgud liiguvad selle asemel jõulöögimehhanismi abil."Kindlasti oleme kõvasti langenud Browni põrklaagri kasuks ja jõulöögi laagri vastu," ütleb Block. "Aga kas see tähendab, et kõik jõukäiguga mudelid on välistatud ja et kõik Browni põrkmehhanismi mudelid on vastuvõetavad? Ei."
Molekulaarne voltimine
Blocki meeskond rakendas uut jõuklambri tehnoloogiat ka ühes biomeditsiiniuuringute kuumimas valdkonnas – molekulaarses voltimises. Selleks, et valk korralikult toimiks, peab see kokku voltima konkreetseks, keerukaks kolmemõõtmeliseks kujundiks. Sellised haigused nagu Alzheimeri tõbi, hullu lehma ja Parkinsoni tõbi võivad tekkida, kui valgud ei voldi oma õigesse 3-D konformatsiooni. Meditsiiniuurijad püüavad lahendada müsteeriumi, kuidas valgud kokku klappivad, lootes ühel päeval need ja muud haigused ravida.
Ajakirjas Physical Review Letters avaldatud katses käsitles Blocki rühm üldise voltimise probleemi teatud aspekte lihtsamal skaalal, keskendudes üksikutele DNA juuksenõeltele – volditud struktuuridele, mis võivad tekkida, kui üks DNA ahel paaritub iseendaga. vastupidise ahela asemel."Juuksenõelad on suurepärased mudelid, " ütleb Block. "Hoiddes jõudu konstantsena, saime mõõta ühe DNA juuksenõela voltimis- ja lahtivoltimise üleminekuid angströmi skaalal. Tulevikus võib see aidata meil mõista ja ennustada, millise kuju võtab keerulisem lineaarne valk kolmes etapis. mõõtmete ruum."
Suur edasiminek
Angströmi eraldusvõimega ülistabiilse optilise püüdmissüsteemi väljatöötamine on "suur edasiminek," ütleb Stanfordi Morris Herzsteini bioloogiateaduste professor ja kaasaegse molekulaargeneetika pioneer Charles Yanofsky. Uus seade on nagu "filmide lisamine fotodele, et mõista ensüümide toimet," ütleb ta.
"See tehniline saavutus toob kahtlemata kaasa uue teabe molekulaarmasinate kohta, mis teostavad põhilisi rakuprotsesse, eriti neid, mis on seotud replikatsiooni, transkriptsiooni ja translatsiooniga," lisab Catherine Lewis, riikliku biofüüsika programmidirektor. Üldmeditsiiniteaduste instituut (NIGMS).
"Kui ma vaatan oma kristallkuuli ja näen, kuhu see läheb, siis arvan, et see avab ühemolekulilise biofüüsika välja," ütleb Block. "Oleme saavutanud ühe molekuli jaoks eraldusvõime, mis on võrreldav sellega, mida kristallograaf tavaliselt saavutab millimeetri suuruses kristallis, milles on 1000 triljonit molekuli. Me ei tee seda kõike ainult ühe molekuliga ühe angströmi eraldusvõimega, me teeme seda reaalajas, samal ajal kui molekul liigub toatemperatuuril vesilahuses."
Block märgib, et selle võimaldamiseks kulus aastaid hoolikat instrumentide arendamist, mida rahastasid riiklikud tervishoiuinstituudid, ja Stanfordi ülikooli ehitatud spetsiaalse labori ehitamist ning mõne inimese lihts alt silmapaistvaid jõupingutusi. säravad ja töökad kraadiõppurid ja järeldoktorid siin Stanfordis. Olen selle töö üle eriti uhke."
The Physical Review Letters ja Nature dokumente toetasid NIGMS ja Stanfordi ülikool.
